摘要：狗牙根（Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ Ｌ． Ｐｅｒｓ．）不同居群由南向北外部性状具有广泛的变异性，为明确其分化的分子基础，以收集到的２８份狗牙根为材料，用２０个随机引物（１０bp）共扩增出３１8个ＲＡＰＤ多态性片段，平均每个引物１５．9个多态位点，在２４个居群中共检测到了４６个特异性片段；３种类型有８％的多态性片段明显不同；相似生境或同一地域的居群在一些位点上表现出相似或相同的变化。
关键词：狗牙根（Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ Ｌ． Ｐｅｒｓ．）；遗传分化；ＲＡＰＤ
中图分类号：Ｓ５４３．９文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）13－2706-04
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ Ｂｙ ＲＡＰＤ Ａｎａｌｙｓｉｓ
ＬIANG Ｙｕｅ－ｘｉａｎｇ１，２，ＬＩＡＮＧ Ｈｕｉ－ｍｉｎ１，ＸＩＡ Ｙａｎｇ３，ＹＡＮ Ｌｉ－ｐｉｎｇ３，ＬＩＵ Ｃｕｉ－ｌａｎ３
（１．Agriculture Department of Ｊｉａｎｇｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｊuｒｏｎｇ ２１２４００， Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｎｉｎｇｘｉａ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５０００２，Ｃｈｉｎａ；
３．Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｊｉｎａｎ ２５００１４， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅｒｅ ｅｘｉｓｔｅｄ ａｂｕｎｄａｎｔ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ bｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ（Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ Ｌ． Ｐｅｒｓ．） ｆｒｏｍ ｓｏｕｔｈ ｔｏ ｎｏｕｔｈ． Ｔｏ ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｅｓ ｏｆ ｉｔｓ ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， 314 ＲＡＰＤ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ２８ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ bｅｒｍｕｄａｇｒａｓｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ２０ ｐｒｉｍｅｒｓ（10nt）． Ｔｈｅ ｍｅａｎ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｗａｓ １５．7 ｐｅｒ ｐｒｉｍｅｒ． ４６ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ２４ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ． ８％ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｅｖｉｄｅｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｔｙｐｅｓ． Sｉｍｉｌａｒ ｏｒ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ were represented ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒ ｈａｂｉｔａｔ ｏｎ ｃｅｒｔａｉｎ ｌｏｃｉ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ Ｌ． Ｐｅｒｓ．； ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ； ＲＡＰＤ
植物种群随地理距离的遗传分化，在形态、等位酶和ＤＮＡ等不同水平上已被许多研究者发现。最近许多研究发现，在植物种群中，遗传分化也在较小的地理范围内发生［１，２］。
狗牙根（Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ Ｌ． Ｐｅｒｓ．）是暖季型多年生草皮型草种，属世界广布种［３］。生长于不同地理居群的狗牙根，在不同的土壤、水分、温度等生态因子的作用下，经过长期的适应和进化过程，在生长范围和习性上有极大的多样性，居群间产生了不同程度的分化［１，４］。
本项研究以收集到的２８份狗牙根，包括国内不同地方野生和坪用型及国外引进商业品种种质资源（居群）为材料，通过ＲＡＰＤ技术分析居群间引物扩增片段频率的变化规律及遗传变异性，并结合叶片形态特征，依据聚类分析划分的３种类型［５］找出同一类型或相似生境的特异性条带，为狗牙根的分类研究提供分子水平的参考，并为开展狗牙根分子育种研究奠定基础。
１ 材料和方法
１．１ 植物材料
供试的２８个狗牙根居群来源地及编号列于表１。其中S１～S１２号、S２２～S２８号为中国普通野生型品种，S１３～S２１号为坪用型品种。
１．２ ＲＡＰＤ分子标记
１．２．１植物基因组ＤＮＡ的提取从种质圃中的２８个狗牙根居群中，每个居群随机选取１０个单株，混和剪取新鲜幼嫩叶片１０～２０ ｍｇ，用冰壶带回实验室流水冲洗干净，去离子水冲洗３遍，吸水纸吸干水分后用改良的ＣＴＡＢ方法提取总ＤＮＡ［５］。
１．２．２ＲＡＰＤ的ＰＣＲ扩增与检测ＤＮＡ扩增在ＰＴＣ ＤＮＡ ＥｎｇｉｎｅＴＭ ｓｙｓｔｅｍｓ ＰＣＲ仪上进行，ＰＣＲ反应体系为２０ μＬ，扩增产物在凝胶成像系统中拍照，保存图片。
１．２．３引物筛选筛选了Ｏｐｒｏｎ公司生产的２２０个１０ ｂｐ的随机引物，选择扩增条带丰富、重复性好的２０个引物进行ＲＡＰＤ试验，所使用的引物序列见表２。
１．２．４数据分析首先用２个不同生态点的野生狗牙根和一个坪用型狗牙根为材料，筛选合适的引物。在选用的２２０个引物中，最后选取了２０个对所有供试的２８份材料具有多态性且扩增效果重复性好的引物进行ＲＡＰＤ分析，收集０．２５～２．００ｋｂ范围内的ＲＡＰＤ数据。记录时只记录那些谱带清晰并在重复试验中稳定出现的带，不分强弱，并设对照。每个样品的扩增条带按有或无记录，存在时赋值为１，否则赋值为０。统计多态性位点，计算多态位点比率，并找出同一类型或相似生境的特异性条带，结合叶片形态特征进行分析。
２结果与分析
２．１不同引物ＲＡＰＤ扩增片段频率的变化及多态性
２０个引物共扩增出３30个ＲＡＰＤ位点，其中单态位点１２个，多态位点３１8个，总计９６．３6％的位点是多态的，各引物检测到的ＲＡＰＤ多态位点数在１１～２１之间，平均每个引物可检测出１５．9个多态位点。２０个引物扩增的多态位点比率都在０．８以上，其中１１个引物的扩增位点全部为多态（表２）。由于ＲＡＰＤ位点是一种显性标记，通常一条带代表基因组一个位点的产物，这就意味着对狗牙根基因组的３30个位点进行了检测。引物OPN2和OPN10的扩增结果见图1。
２．２各居群ＲＡＰＤ扩增片段频率的变化
随机扩增后，有一些ＲＡＰＤ位点的扩增片段频率在居群间表现出规律性的变化。在１２个单态位点上，狗牙根２８个居群在ＲＡＰＤ图谱上有共同的扩增片段，分别是ＯＰＮ２－５００，ＯＰＮ１０－５００，ＯＰＮ１４－７５０，ＯＰＮ９－８００，ＯＰＮ１２－８５０，ＯＰＮ１６－１０００，ＯＰＮ１６－７５０，ＯＰＮ１６－５５０，ＯＰＧ１０－１０００，ＯＰＧ１０－７５０，ＯＰＳ１１
－１０００，ＯＰＪ１５－５２０，各居群在这１２个位点上的扩增频率均为１．０。在统计的３１４个多态位点中，有些是狗牙根不同居群或类型中特有的扩增片段，其扩增片段频率均为０．８以上，其中一些代表性的差异扩增片段结果列于图2～4。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文由图2可见，供试的２８个居群中，除了３号、１６号、２３号和２４号居群没有检测到特异性扩增片段外，其他２４个居群在４６个不同的位点上均检测到了特异性扩增片段，占总扩增片段的１3．94％，扩增片段频率均为１．０的居群有２３个，其他居群在这些位点没有扩增或扩增频率很低。有特异性标记的居群占供试居群的８５．７１％。这些结果表明在这些位点上居群之间存在着差异性片段。
依据叶片质地大小不同和聚类分析划分的３种类型［５］在一些位点上表现出明显的差异（图3）。Ｉ型（叶片宽长）在ＯＰＮ２－７８０、ＯＰＮ１０－８００、ＯＰＮ１０－２５０、ＯＰＮ１４－１５５０、ＯＰＮ９－７５０、ＯＰＮ６－５００、ＯＰＧ１０－１４００、ＯＰＧ１０－８５０、ＯＰＳ１２－３５０、ＯＰＳ１９－６８０、ＯＰＪ１５－６５０、ＯＰＪ１８－１１００这１２个位点均有扩增片段，且扩增频率均大于０．８，而其他２个类型在这些位点扩增频率很低或没有扩增；Ⅱ型（叶片细长）在ＯＰＮ１２－１９００、ＯＰＳ１１－７５０、ＯＰＪ１３－７５０、ＯＰＪ１５－９５０这４个位点均有扩增片段，且频率大于０．８，而另２个居群在这几个位点扩增频率很低或没有；Ⅲ型（叶片宽长中等）在ＯＰＮ１０－２０００、ＯＰＮ１０－１０００、ＯＰＮ９－９５０、ＯＰＮ１２－１８００、ＯＰＮ１６－１５００、ＯＰＮ１６－１０５０、ＯＰＧ１０－５００、ＯＰＳ１３－８５０、ＯＰＪ１３－３８０、ＯＰＪ１５－５５０这１０个位点，也是扩增频率均大于０．８，而另２个居群在这１０个位点频率很低或没有。
生长在相似环境的居群在一些位点上也检测到了相同或相似的扩增片段（图4）。ＯＰＮ２－７００、ＯＰＮ１４－８５０、ＯＰＮ８－１２００、ＯＰＮ９－７００、ＯＰＮ９－４００、ＯＰＮ６－１０００这６个位点主要存在于来自广东的４个野生型居群，扩增频率均大于０．８；ＯＰＮ１６－２０００位点只在南京的２个野生型居群中存在，扩增频率均为１．０；ＯＰＮ１５－１６００、ＯＰＳ１３－９００、ＯＰＪ１０－４５０、ＯＰＪ１３－４００、ＯＰＪ１５－５５０、ＯＰＪ１８－６５０这６个位点主要在来自于山东的济南、章丘、历城、长清的４个野生型居群中表达，扩增频率均为１．０；而ＯＰＮ１５－５００、ＯＰＪ１８－３５０、ＯＰＮ１６－１９５０这３个位点只在来自于山东泰安和淄博的２个居群表达，ＯＰＪ１５－９００、ＯＰＧ１０－４５０这２个位点只存在于来自江苏南京、句容、江宁的５个无性系居群，而其他居群没有相应扩增或扩增频率很低。
３讨论
狗牙根属种内营养器官的变异远比种内生殖器官的特征变异大［６］。刘建秀等［７］指出华东地区狗牙根的外部形态特征与Ｃ．ｄａｃｔｙｌｏｎｖａｒ很相近，两者均具有粗状到纤细、灰绿到深绿、染色体从４倍到６倍的种源存在。由于狗牙根属是一个种类繁多、形态变异复杂，含有二倍体、三倍体、四倍体和六倍体的多年生禾草，无论是从形态学还是细胞学水平上进行的分类都是由几个形态特征或生理生化特性的基因控制，它们在整个遗传信息中所占比例很小，所以这些分类都有很大缺陷。ＲＡＰＤ技术通过多个不同的随机引物给出覆盖整个基因组的多态性信息，且不受环境因素的影响，能直接从ＤＮＡ分子中检测出序列的变化，在ＤＮＡ水平上揭示群体的遗传变异，所以利用ＲＡＰＤ指纹图谱可以反映种内或种间关系、居群间关系和基因组间的关系［８－１３］。
本试验所用２８份材料分别来源于国内多个市县的不同地区，代表了国内野生狗牙根的部分区域，另外也包括少量国外育成品种（主要是三倍体）在国内不同地区交换种植且时间较长，所以遗传性状也会发生变异。２０个引物在２８份材料之间均具有多态性，其ＲＡＰＤ扩增的总多态位点比率达９６．３6％，揭示出中国野生狗牙根不同居群间、国外引进品种的不同居群间存在着复杂的遗传性状，具有丰富的遗传多样性。对于狗牙根基因组ＤＮＡ多态性明显偏高的特点，可以进一步证实众多研究者从生态等角度发现的狗牙根种内拥有大量可供遗传变异选择的基因型，这些丰富的遗传变异的存在，正是狗牙根能形成众多品种的分子基础。
狗牙根广泛分布于我国黄河流域及其以南地区，在新疆亦有较广泛的分布，其种质资源非常丰富，在外部性状和抗逆性等方面差异也很大。但近年来由于人类的活动使狗牙根居群范围迅速缩小，所以很难沿着一个土壤梯度集中取样形成一个渐变群。在此项研究中，相同地域或相似生境居群亲缘关系较近，在一些位点上显现出相同或相似的变化，具有相同的特异性位点，表明相同地域或相似生境的狗牙根之间的遗传基础更接近。根据不同居群狗牙根ＲＡＰＤ扩增片段频率的变化又可以看出狗牙根不同居群间确实存在着差异。
参考文献：
［１］ 刘惠芬，高玉葆，王 丹，等．内蒙古典型草原羊草种群遗传分化的ＲＡＰＤ分析［Ｊ］．生态学报，２００４，２４（３）：４２３－４３１．
［２］ 崔继哲，祖元刚，关晓铎．羊草种群遗传分化的ＲＡＰＤ分析Ｉ：扩增片段频率的变化［Ｊ］．植物研究，２００１，２１（２）：２７２－２７７．
［３］ ＨＡＲＬＡＮ Ｊ Ｒ，ＤＥ ＷＥＴ Ｊ Ｍ Ｊ． Ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ （Ｌ）． Ｐｅｒｓ．１［Ｊ］． Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６９，９（６）：７７４－７７８．
［４］ 郑玉红，刘建秀，陈树元． 中国狗牙根（Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ）优良选系的ＲＡＰＤ分析［Ｊ］．植物资源与环境学报，２００５，１４（２）：６－９．
［５］ 梁慧敏．不同居群狗牙根ＲＡＰＤ分析［Ｊ］．草业学报，２０１０，１９（１）：２５８－２６２．
［６］ 刘建秀，贺善安，刘永东，等． 华东地区狗牙根形态分类及其坪用价值［Ｊ］． 植物资源与环境，１９９６，５（３）：１８－２２．
［７］ 刘建秀，郭爱桂，郭海林．我国狗牙根种质资源匍匐性的研究［Ｊ］． 中国草地，２００２，２４（２）：１２－１５．
［８］ 田志宏，邱永福，严寒，等．用ＲＡＰＤ标记分析高羊茅的遗传多样性［Ｊ］． 草业学报，２００７，１６（１）：５８－６３．
［９］ ＭＥＮＧＩＳＴＵ Ｌ Ｗ，ＭＵＥＬＬＥＲ－ＷＡＲＲＡＮＴ Ｇ Ｗ，ＢＡＲＫＥＲ Ｒ Ｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｏａ ａｎｎｕａ ｉｎ ｗｅｓｔｅｒｎ Ｏｒｅｇｏｎ ｇｒａｓｓ ｓｅｅｄ ｃｒｏｐｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ，２０００，１０１（１２２）：７０－７９．
［１０］ ＣＡＳＬＥＲ Ｍ Ｄ，ＲＡＮＧＥＬ Ｙ，ＳＴＩＥＲ Ｊ Ｃ，ｅｔ ａｌ． ＲＡＰＤ ｍａｒｋｅｒ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｍｏｎｇ ｃｒｅｅｐｉｎｇ ｂｅｎｔｇｒａｓｓ ｃｌｏｎｅｓ［Ｊ］． Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，４３（２）：６８８－６９３．
［１１］ ＦＥＲＤＩＮＡＮＤＥＺ Ｙ Ｓ Ｎ，ＳＯＭＥＲＳ Ｄ Ｊ，ＣＯＵＬＭＡＮ Ｂ Ｅ． Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄ ｂｒｏｍｅｇｒａｓｓ ｔｏ ｓｍｏｏｔｈ ｂｒｏｍｅｇｒａｓｓ ａｎｄ ｍｅａｄｏｗ ｂｒｏｍｅｇｒａｓｓ ｕｓｉｎｇ ＲＡＰＤ ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］． ＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００１，１２０（２）：１４９－１５３．
［１２］ ＧＯＬＥＭＢＩＥＷＳＫＩ Ｒ Ｃ，ＤＡＮＮＥＢＥＲＧＥＲ Ｔ Ｋ，ＳＷＥＥＮＥＹ Ｐ Ｍ． Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ＲＡＰＤ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｅｅｐｉｎｇ ｂｅｎｔｇｒａｓｓ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ［Ｊ］． Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，３７：２１２－２１４．
［１３］ ＳＣＨＥＥＦ Ｅ Ａ，ＣＡＳＬＥＲ Ｍ Ｄ，ＪＵＮＧ Ｇ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｐｅｃｉｅｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＣＡＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｂｅｎｔｇｒａｓｓ［Ｊ］．Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，４３（１）：３４５－３４９．
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文
