革兰染色法的四个步骤：革兰染色法

器材和试剂

显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、吸管、菌种、培养基、革兰染色液、生理盐水等。

原理：

1.革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；而革兰阴性菌细胞壁结构较疏松，肽聚糖层少，脂质含量多，乙醇易渗入。

2.革兰阳性菌的等电点低（pI2～3），革兰阴性菌等电点较高（pI4～5），在相同pH条件下，革兰阳性菌所带阴电荷比革兰阴性菌多，与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固且不易脱色。

3.革兰阳性菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，可与结晶紫和碘牢固地结合成大分子复合物，不易被乙醇脱色；而革兰阴性菌细胞内含极少量的核糖核酸镁盐，吸附染料量少，形成的复合物分子也较小，故易被乙醇脱色。

操作方法：

1．细菌涂片标本的制作

（1）涂片：取洁净载玻片一张，用玻璃铅笔于玻片上划个直径1.5cm左右的圆圈。用接种环在圆圈内各加1环生理盐水。接种环灭菌后，挑取细菌少许在盐水中磨匀，呈轻度混浊。涂好的菌膜大小一般以1cm2左右为宜。每次取菌前后注意将接种环灭菌。如果是液体培养物可直接涂抹于洁净的载玻片上。

（2）干燥：涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于酒精灯火焰高处慢慢烘干，切不可在火焰上烧干。

（3）固定：细菌的固定常用火焰加热法，即将上述已干的涂片在酒精灯火焰中通过3次。固定的目的在于杀死细菌，并使菌体与玻片粘附牢固，染色时不致于被染液和水冲掉，同时固定可凝固细胞质，改变细菌对染料的通透性。

2.细菌涂片标本的染色

（1）初染：将结晶紫染液加于制好的涂片上，染色 1min，用细流水冲洗，甩去积水。

（2）媒染：加卢戈碘液作用1min，用细流水冲洗，甩去积水。

（3）脱色：滴加95%酒精数滴，摇动玻片数秒钟，使均匀脱色，然后斜持玻片，再滴加酒精，直到流下的酒精无色为止（约0.5min），用细流水冲洗，甩去积水。

（4）复染：加稀释石炭酸复红染0.5min，用细流水冲洗，甩去积水。

待标本片自干或用吸水纸吸干后，在涂片上滴加香柏油，置油镜下观察。

结果判定：被染成紫色的细菌为革兰阳性菌；被染成红色的细菌为革兰阴性菌。

影响因素：

1.操作因素：涂片太厚或太薄，固定时菌体过分受热，以及脱色时间长短，都会影响染色结果。

2.染液因素：所有染液应防止染液蒸发而改变浓度，特别是卢戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用；涂片积水过多会改变染液浓度，影响染色效果，如脱色用的乙醇以95%为宜，浓度降低会增强其脱色能力。

3.细菌因素：细菌的菌龄不同，革兰染色结果也有差异，一般以18～24h的培养物染色效果最好，菌龄过长影响细菌染色性。