玉米幼苗的根是由什么发育而来的？幼年玉米根际中的细菌种群来源于种子和土壤

文：回溯档案编辑：回溯档案

玉米是现代农业中产量最高、最重要的植物之一，对玉米微生物组的研究旨在通过了解生活在植物内部和表面的微生物种群的生态学，进一步提高其生产力和抗逆性，生活在植物体内的微生物被称为内生菌，鉴于两者之间的密切接触，可能对植物生长和健康产生直接影响。

同时生活在植物表面的微生物称为附生植物；那些生活在叶圈或叶表面的生物栖息在地球上最大的生物表面积，但生活在根表面和附着土壤（根际）上的细菌存在于养分和水的关键吸收部位。

植物通过根部分泌多种化合物到周围土壤中来喂养和操纵生活在那里的微生物，从而影响其根际的微生物组成。这些分泌物代表植物能量和资源的消耗，总计高达植物固定碳的 40%，尽管拟杆菌门、放线菌门和厚壁菌门在这两个生态位中也很常见，但酸杆菌门和浮霉菌门仅在根际中常见。

虽然叶际细菌的起源仍然不明确，但内生细菌和根际细菌的起源;，传统上被认为来自土壤，与土壤起源相反，有证据表明玉米种子内部和/或表面的细菌内生菌构成了根内圈细菌种群的大部分，并且至少其中一些细菌能够在植物内传播，离开根部并在根际定殖。

类似的证据表明，在水稻植物的内圈和根际微生物群中也发现了种子内生菌，而对生长在裸露沙漠岩石上的卡东仙人掌的研究表明，幼苗依靠种子传播的细菌在根际定植，以帮助溶解岩石基质，帮助植物吸收营养。

敏感分子指纹识别和经济实惠的下一代测序技术的出现引发了根际研究的复兴，许多关于玉米根际细菌多样性的新研究、拟南芥根际和其他重要植物物种的根际。

为了更好地梳理玉米植物叶际、内层和根际细菌种群的起源及其影响，在这项研究中，我们获得了两种不同的玉米基因型，并将它们种植在三种截然不同的基质中，Lenha 地方品种是一种未经化学处理的种子，是一种来自巴西的古老、开放授粉品种，具有粗棒棒子，之所以如此命名，是因为据信土著人民将它们用作柴火。

为了进行基因型对比，EMBRAPA 培育的杂交种 BRS 1030是从农药和杀菌剂包被的种子中培育出来的，代表了工业化农业中抗逆性和抗病性培育的优良品种，尽管已知这种特殊品种对接种有益细菌有反应。

这些不同的基因型在三种微生物截然不同的基质上生长，以研究土壤作为根际、内圈或叶际微生物来源的能力，通过在高压釜中对石英砂反复加热灭菌，将其中一种基质作为微生物阴性对照，选择第二个基质来代表以前没有接触过植物的土壤，并且预计不含与植物相关的微生物；这种粉状底土取自巴西铁矿地下 400 m 处。

最后，为了观察富含营养和微生物的表土对玉米微生物组的影响，我们获得了从马瑙斯市附近的巴西亚马逊丛林内的一个考古遗址收获的 terra preta do indio，

为了表征植物基因型和土壤基质对玉米微生物组的影响，将两种玉米基因型在温室中并排种植在三种基质中，通过提取和扩增植物相关微生物生态位中的细菌 DNA，对所有样品进行物种多样性分析，并使用来自 DNA 指纹技术的 16S rDNA 数据的主成分分析，末端片段长度多态性分析 (TRFLP) 比较细菌种群结构的变化。

另外还使用 16S rDNA 的 Miseq 分析研究了根际 DNA。测序数据使我们能够测量不同系统型的丰度，使我们能够估计玉米根际细菌种群的相对大小，我们预计观察到叶际和根内圈细菌多样性受植物基因型的影响最大，而根际则主要由土壤传播的细菌组成，我们讨论了结果以及数据对这些细菌种群起源的暗示。

为了研究根和芽表面，将 5 叶阶段的整个植物小心地摇动，使其脱离任何土壤，在根/芽边界处切割，除去腐烂的种子壳，进一步摇动根以除去任何可见的多余土壤，然后将根和芽放入单独的无菌 50 mL 锥形管中。

40 ml 无菌 50 mM Na 2 HPO 4将含有 0.1% Tween 20 的缓冲液添加到每个管中，用手短暂摇动，然后在 T7 型超声水浴中以 22.5 kHz 超声处理 10 分钟，以去除植物表面的土壤颗粒和微生物，然后将根际和叶际洗涤液在 4°C 下以 15,000 g 离心 15 分钟，生成沉淀，去除上清液，将沉淀悬浮于 4 mL 磷酸盐缓冲液中，然后冷冻以供后续 DNA 提取。

将根组织置于干净的锥形管中，并用无菌磷酸盐缓冲液进一步冲洗，直至在洗涤液中不再观察到浑浊，然后用 2.5% 次氯酸钠处理洗过的根，并如前所述超声处理 10 分钟，排出漂白剂，并用 2.5% 次氯酸钠重复处理并超声处理 10 分钟。

然后将样品沥干并用高压灭菌的蒸馏水冲洗，然后用 70% 乙醇冲洗 10 分钟，除去乙醇，并用高压灭菌的蒸馏水冲洗样品三次，为了检查表面无菌性，每次处理将一块组织暂时放置在无菌 R2A 琼脂板上，在 25°C 下孵育 10 ，将表面消毒的根放入高压灭菌的研钵中，并通过用无菌陶瓷杵压碎来研磨，HPO 缓冲液和这种“根汁”被倒入一个新鲜的试管中，然后冷冻以供随后的 DNA 提取。

为了收集精子球，将 Lenha 和 EMBRAPA 基因型各 5 个种子浸泡在 5 mL 含有 0.1% Tween 20 的无菌 50 mM 磷酸钾缓冲液中 24 小时，然后用手短暂摇动，然后在 T7 型超声水浴中以 22.5 kHz 超声处理 10 分钟，以去除种子表面的微生物，将所得种子洗液在 4°C 下以 15,000 g 离心 15 分钟进行浓缩，倾析出上清液，将沉淀悬浮在 500 μL 新鲜磷酸盐缓冲液中，然后冷冻以供后续 DNA 提取。

使用 PowerSoil® DNA 分离试剂盒从每种土壤的 3 个样品以及每组叶际、根际、精子层和根内圈的 5 个样品中提取总 DNA，使用 Nanodrop对 DNA 进行定量。

使用巢式 PCR 方法扩增低滴度微生物样品，以生成足够的 TRFLP 产物，每 25 μl 体积使用以下成分制备 PCR 主混合物：2.5 μl 标准 Taq 缓冲液、0.5 μl 25 mM dNTP 混合物、0.5 μl 10 mM 27 F-Degen 引物，序列为 5'-AGRRTTYGATYMTGGYTYAG-3'、0.5 μl 10 mM 1 492r 引物，序列为 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，0.25 μl 50 mM MgCl 2、0.25 μl 牛血清白蛋白、0.25 μl Standard Taq、20 ng 总 DNA 和双蒸水，总计 25 μl。

使用以下程序在 PTC200 DNA 热循环仪中进行 35 个循环的扩增：96°C 3 分钟，35X（94°C 30 秒，48°C 30 秒，72°C 1:30 分钟），72°C 7 分钟。

使用与上述相同的条件，将 1.0 μl 上述 PCR 产物用作巢式荧光标记 PCR 反应的模板。对于巢式PCR，用6FAM标记具有序列5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3'的引物799f，用Max550标记具有序列5'-ACGGGCGGTGTGTRC-3'的1389r引物，均由Integrated DNA Technologies（美国）标记。

选择正向引物 799 F 是因为它强烈偏向于扩增叶绿体 16S rDNA；放大和限制后，但在进行统计分析之前，更大的线粒体 18S 片段随后被通过计算机去除。

通过使用引物 799f 和 1389r 将 10 ng DNA 扩增 40 倍，对根际、精子层、土壤和水样进行无巢式扩增。然后将 1.5 μl 标记的 PCR 产物添加到 8.5 μl 限制性混合物中，并在 37 °C 下黑暗中孵育 16 小时，然后使用 3730 DNA 分析仪和 GeneScan 1200 LIZ 尺寸标准品通过测序凝胶进行分析，每个基因型/处理组合有 5 个生物重复，每个土壤有 3 个重复。

PCR 扩增使用通用细菌 16S rDNA 引物 515 F 和 806R 进行，遵循先前发布的方案，其中每个模板分子在通过 PCR 指数扩增之前通过线性扩增步骤被赋予独特的序列或分子标签，将抗叶绿体和抗线粒体肽核酸 (PNA) 阻断剂添加到 PCR 反应中，以阻断叶绿体和线粒体的扩增。

PCR程序为95℃变性45秒，随后34个循环：95℃变性15秒，PNA在78℃退火10秒，引物在60℃退火30秒，72℃延伸30秒，然后冷却至4℃，所有样品均使用 Agencourt 珠子进行清洁，使用 35 μL 珠子清洁 50 μL PCR ，DNA 在 50 μL 水中洗脱。在 Illumina MiSeq 平台上以单次 2 × 250 bp 双端运行对 16S rRNA 基因高变区 4 的扩增子进行测序，使用 CASAVA v1.8.2 软件进行序列读取的多路分离。

使用 MT-Toolbox 软件处理序列读数，该软件从带有相同分子标签的两个或多个序列中生成共有序列 (conseq)，从而纠正序列错误和偏差。仅使用代表两个或多个原始读数的 conseq 进行分析。然后使用 USEARCH 6 将 Conseq 以 97% 序列相似性阈值分类为操作分类单位 (OTU) ，并使用脚本为 OTU 分配分类身份，其中 RDP 分类器在洛斯阿拉莫斯国家实验室的 GreenGenes 分类参考文献上进行了训练。

在 QIIME v1.5.0 包中，OTU 计数导出至 Excel进行进一步分析，并作为“Raw Conseq Counts”包含在电子补充材料中，Miseq 观察到的 1059 个 OTU 序列作为 FASTA 文件“OTU 序列”包含在电子补充材料中。

通过比较在无菌沙子中生长的根际中发现的细菌种群，与在地下深处微生物贫乏的土壤中生长的植物以及亚马逊丛林中富含微生物的表土中生长的植物的细菌种群，我们的数据表明，在这个生态位中发现的大多数细菌细胞来自种子，要么作为内部的内生菌，要么作为表面的附生菌，两个玉米品种之间根际细菌多样性差异的证据可以解释为基因型效应或种子处理效应。

当然，土壤确实增加了玉米根际居民的多样性，但只贡献了少量的多种不同细菌属，而不是在该生态位中安装优势群体，既没有土壤，基因型似乎也不影响叶际或根内圈细菌种群，尽管对较古老或遗传上不同的植物进行的实验可能会显示出不同的结果，我们的数据表明，试图改变和优化玉米根际以帮助抗病和抗逆、养分获取和根部发育的科学家和农民，如果他们集中精力扰乱种子相关的微生物组而不是土壤微生物组，可能会更成功。

参考文献

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